在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中，熒光定量 PCR 儀已成為基因分析的關(guān)鍵設(shè)備。對(duì)于使用熒光定量 PCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增的實(shí)驗(yàn)，判斷擴(kuò)增產(chǎn)物是否為目標(biāo)基因至關(guān)重要。蘇州阿爾法生物實(shí)驗(yàn)器材有限公司作為專業(yè)的實(shí)驗(yàn)器材供應(yīng)商，為眾多科研及醫(yī)療客戶提供優(yōu)質(zhì)的熒光定量 PCR 儀及相關(guān)技術(shù)支持。下面，我們將詳細(xì)介紹在熒光定量 PCR 擴(kuò)增過(guò)程中判斷擴(kuò)增產(chǎn)物是否為目標(biāo)基因的方法。

熒光定量 PCR 儀的工作原理簡(jiǎn)述

熒光定量 PCR 儀

     熒光定量 PCR 儀是利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè) PCR 進(jìn)程的儀器。在 PCR 反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，隨著 PCR 反應(yīng)的進(jìn)行，擴(kuò)增產(chǎn)物不斷累積，熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。通過(guò)對(duì)熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，可繪制出熒光擴(kuò)增曲線。常用的熒光標(biāo)記方法有 SYBR Green 染料法和 TaqMan 探針?lè)āYBR Green 染料能非特異性地嵌入 DNA 雙鏈小溝，激發(fā)后發(fā)射熒光，其熒光強(qiáng)度與雙鏈 DNA 含量成正比。TaqMan 探針?lè)▌t是在引物之外設(shè)計(jì)一條與目標(biāo)序列互補(bǔ)的寡核苷酸探針，探針兩端分別標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)，在 PCR 擴(kuò)增時(shí)，Taq 酶的 5'→3' 外切酶活性切割探針，使報(bào)告基團(tuán)釋放熒光，熒光信號(hào)與目標(biāo) DNA 拷貝數(shù)成正比。

基于熔解曲線分析判斷目標(biāo)基因

  熔解曲線分析是熒光定量 PCR 實(shí)驗(yàn)中判斷擴(kuò)增產(chǎn)物特異性的重要手段。在 PCR 擴(kuò)增結(jié)束后，逐漸升高溫度，雙鏈 DNA 會(huì)解鏈成為單鏈，此時(shí)熒光信號(hào)會(huì)發(fā)生變化。對(duì)于目標(biāo)基因的擴(kuò)增產(chǎn)物，其熔解溫度（Tm 值）是相對(duì)固定的。因?yàn)椴煌?DNA 序列具有不同的堿基組成和排列，GC 含量高的 DNA 雙鏈相對(duì)更穩(wěn)定，其 Tm 值也較高。如果擴(kuò)增產(chǎn)物是單一的目標(biāo)基因，熔解曲線會(huì)呈現(xiàn)出單一、尖銳的峰。例如，在對(duì)某已知基因進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，該基因的理論 Tm 值為 85℃，若實(shí)驗(yàn)得到的熔解曲線在 85℃左右出現(xiàn)明顯單峰，且與陰性對(duì)照（無(wú)模板）和非特異性擴(kuò)增對(duì)照（引物二聚體等）的熔解曲線有明顯差異，就初步表明擴(kuò)增產(chǎn)物很可能是目標(biāo)基因。而若熔解曲線出現(xiàn)多個(gè)峰，可能存在非特異性擴(kuò)增，如引物二聚體產(chǎn)生的峰，引物二聚體的 Tm 值通常較低，一般在 70℃ - 80℃之間，通過(guò)與目標(biāo)基因理論 Tm 值對(duì)比以及經(jīng)驗(yàn)判斷，可以識(shí)別并排除。

基因測(cè)序

結(jié)合引物設(shè)計(jì)與擴(kuò)增片段大小判斷

  合理的引物設(shè)計(jì)是確保擴(kuò)增出目標(biāo)基因的基礎(chǔ)。在設(shè)計(jì)引物時(shí)，要保證引物與目標(biāo)基因序列具有高度特異性互補(bǔ)，并且避免引物自身或引物之間形成二聚體等結(jié)構(gòu)。通過(guò)引物設(shè)計(jì)軟件，可以對(duì)引物的特異性、Tm 值、GC 含量等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。當(dāng)熒光定量 PCR 擴(kuò)增結(jié)束后，可通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳來(lái)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小。目標(biāo)基因的擴(kuò)增片段大小是已知且固定的，根據(jù)設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增區(qū)域，可計(jì)算出理論的擴(kuò)增片段長(zhǎng)度。例如，設(shè)計(jì)擴(kuò)增某基因的一段 150bp 的片段，在凝膠電泳中，若觀察到清晰的條帶且其遷移位置與 150bp 的 DNA Marker 位置相符，結(jié)合熒光定量 PCR 的熒光信號(hào)情況，可進(jìn)一步佐證擴(kuò)增產(chǎn)物為目標(biāo)基因。若出現(xiàn)其他大小的條帶，則可能存在非特異性擴(kuò)增。 

測(cè)序驗(yàn)證擴(kuò)增產(chǎn)物

   最為準(zhǔn)確判斷擴(kuò)增產(chǎn)物是否為目標(biāo)基因的方法是對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。將熒光定量 PCR 擴(kuò)增得到的產(chǎn)物進(jìn)行純化后，送至專業(yè)的測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序。通過(guò)測(cè)序得到的堿基序列與目標(biāo)基因的已知序列進(jìn)行比對(duì)，如果匹配，那么可以確鑿地證明擴(kuò)增產(chǎn)物就是目標(biāo)基因。這種方法雖然成本較高且操作相對(duì)復(fù)雜，但在科研工作中，當(dāng)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性要求高，或?qū)U(kuò)增產(chǎn)物的性質(zhì)存在疑問(wèn)時(shí)，測(cè)序驗(yàn)證是常用的手段。例如，在研究新發(fā)現(xiàn)的基因或?qū)膊∠嚓P(guān)基因的精確分析中，測(cè)序可以明確擴(kuò)增產(chǎn)物是否發(fā)生了基因突變、缺失或插入等情況，為后續(xù)的研究提供精準(zhǔn)的數(shù)據(jù)支持。

   熒光定量 PCR 儀在擴(kuò)增過(guò)程中，通過(guò)熔解曲線分析、結(jié)合引物設(shè)計(jì)與擴(kuò)增片段大小判斷以及測(cè)序驗(yàn)證等多種方法的綜合運(yùn)用，能夠準(zhǔn)確判斷擴(kuò)增產(chǎn)物是否為目標(biāo)基因。蘇州阿爾法生物不僅提供高品質(zhì)的熒光定量 PCR 儀，還可為客戶提供專業(yè)的技術(shù)咨詢與實(shí)驗(yàn)方案指導(dǎo)，助力科研人員順利開展實(shí)驗(yàn)，獲取準(zhǔn)確可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。